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【POCT】精准医疗趋势下的免疫层析发展——示踪物质篇

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什么是免疫层析技术

 

免疫层析技术(immunochromatography assay,ICA)是20世纪末发展起来的一种结合了免疫反应和色谱层析技术的膜检测分析方法,过程中通过示踪物质的信号转化实现对免疫反应结果的检测。

 

作为标记免疫分析技术的一种,免疫层析技术在临床检验医学的发展历程有着不可替代的地位。发展至今,免疫层析从之前的只能实现定性检测、半定量检测,到现在的定量检测、高灵敏度项目检测,检测的灵敏度与准确度都在不断的提高,不难发现,这其中的每一次变革也都伴随着示踪物质的更新换代。

 

 

示踪物质的发展历程

 

 

​【第一代示踪物质

第一代免疫层析示踪物质以胶体金、彩色胶乳微球为代表,实现了免疫层析技术的定性及半定量检测

 

 

胶体金      

  

胶体金,是指分散相粒子直径在1~150nm之间的金溶胶,属于多相不均匀体系,颜色呈橘红色到紫红色,可以吸附生物大分子且不影响生物分子的活性,所以可以用作生物分子的标志物。以胶体金为示踪物质的免疫层析技术始创于20世纪70年代,在20世纪90年代开始被广泛应用,以人绒毛促性腺激素(HCG)的胶体金免疫层析试纸条为其最典型的应用实例。

 

 

使用胶体金作为免疫层析的示踪物质,几乎可以用于标记所有的蛋白分子,结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼观察即可。但是胶体金需要大量聚集才能显色,使得应用时仅限于定性或者半定量的检测,难以满足临床检测指标定量化的要求,并且在结果读取时,极易受到可见光、样本等带来的环境干扰,检测灵敏度较低。

 

 

【第二代示踪物质】

随着纳米技术的发展,第二代免疫层析示踪物质以荧光微球为代表,开始使用光信号放大系统提高检测的灵敏度。

  

荧光微球

  荧光微球是指直径在纳米级到微米级范围内,并通过物理方法或者化学方法负载有荧光染料的微球。

  与胶体金相比较,荧光微球发光强而稳定,有较高的生物相容性,可以实现定量检测,灵敏度是胶体金的10~100倍。但是由于荧光染料系物理掺杂,易发生荧光泄露,荧光稳定性差;并且在检测时难以消除激发光以及自发荧光带来的环境干扰,检测的灵敏度和准确度因此而受到影响。

 

第三代示踪物质

第三代免疫层析示踪物质在荧光微球的基础上,通过不同的方式增强了示踪物的荧光强度以及抗环境干扰能力,分别以时间分辨荧光、上转发光和量子点为代表。

 

 

时间分辨荧光

 

时间分辨荧光是指含有镧系稀土元素及其螯合物的纳米微球。时间分辨荧光技术首先利用了荧光的波长与其激发光波长的巨大差异克服了普通紫外-可见光分析中杂色光的影响,此外由于稀土元素的荧光寿命较长,可达1~2ms,通常在激发光消失时,普通荧光也消失了,而稀土元素的荧光仍然存在,可在关闭激发光后再进行检测结果测定分析,可有效避免非特异荧光带来的干扰,提高灵敏度。

 

上转发光      

 

上转发光即反Stokes荧光,同样是一种荧光材料,而非发光材料,是由Stokes定律而来。上转发光材料是由2种稀土金属元素(分别作为光吸收子和发射子)掺杂于氧化硫等惰性材料中构成的一类可实现上转换发光的纳米级示踪材料。

 

通常,传统的荧光发射是通过短波长的高能量光激发出长波长的低能量光,称为Stokes效应的下转换发光,而上转发光则是利用了反Stokes效应,使用低能量的红外光激发高能量的短波长光,并通过这种发光特性,有效的避开了环境荧光的干扰,光学背景信号几乎为零,灵敏度高,但也在一定程度上牺牲了荧光强度。

 

量子点         

 

量子点是一类在三个维度尺寸均在纳米数量级的半导体晶体颗粒,其直径常在2到20纳米之间,常见的量子点由Ⅱ-Ⅳ族或Ⅲ-Ⅴ元素组成。按照其结构组成,主要可分为元素半导体量子点,化合物半导体量子点,异质结量子点和金属量子点等,其特殊的光学性质使其成为诸多传统荧光材料的理想替代品。

 

 

量子点材料在1981首次被发现,1998年在science上首次报道了量子点应用于生物标记和细胞成像领域的开创性的研究成果,初步解决了量子点作为生物探针的靶向性和生物相容性问题,并促使量子点真正进入生物荧光标记领域。

 

和传统荧光材料相比,量子点有如下优势:

 

1)量子点的量子效率高,可达90%以上,荧光强度为一般荧光染料(如罗丹明6G)的近20倍。

 

2)量子点抗光漂白,通俗来说就是不怕光照,可经受多次激发,稳定性更是“罗丹明6G”的100倍以上。

 

3)量子点发射峰宽很窄,可有效避免不同荧光之间的干扰。

 

4)量子点不同于有机染料,具有较大的stokes位移,可以避免发射光谱与激发光谱的重叠和环境荧光的干扰,有效提高了检测精确度。

 

5)量子点的荧光寿命长,发光寿命通常在30-100纳秒内,而传统的有机荧光染料的荧光寿命仅有几纳秒,因此可以使用分辨检测来选择性地减少或去除背景荧光,提高信噪比。

 

6) 量子点可以通过改变量子点尺寸和材质改变量子点荧光发射波长,并且激发波长宽,可使用同一波长的光激发不同粒径的量子点而获得不同颜色的标记。

 

 

 

诺唯赞量子点优势

创新纳米量子点发光平台优势

 

基于量子点材料在荧光强度高、抗环境干扰能力强等方面的诸多优势,诺唯赞突破了现有量子点制备技术中的瓶颈,使用独有的油溶性量子点转相技术,使得应用于产品开发的量子点原料既有油溶性量子点的高量子产率,又具备水溶性量子点极佳的水溶性和生物相容性,并且荧光强度上远高于普通荧光素、上转发光,同时有效避开了环境干扰的波长区段,实现了量子产率可控,有效提高了产品的准确度、灵敏度与稳定性。